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岩藻糖敲除宿主细胞株(CHO-K1-TGZ)在抗体药物生产的应用

北京昭衍生物技术有限公司

Beijing JOINN Biologics Co. Ltd.

岩藻糖敲除宿主细胞株(CHO-K1-TGZ)在抗体药物生产的应用

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岩藻糖敲除宿主细胞株(CHO-K1-TGZ)在抗体药物生产的应用

 

一、概述

1986年美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准了首个单抗药物。30多年来,抗体药物领域的发展日新月异,到目前为止,FDA共批准了近百个治疗性抗体药物,主要用于治疗癌症、自身免疫性疾病、传染病等多种疾病。在2021年全球药品销售TOP10排行榜上[1],抗体类药物占5种,其全球销售总额接近700亿美元,治疗性抗体已经成为目前制药行业增长最快,盈利最大的产品之一。

二、抗体抗肿瘤药物发挥作用的基本机理

治疗性抗体中单抗的抗原结合片段(Fab)决定了抗体结合抗原的特异性和亲和力;单抗的恒定区(Fc)通过结合细胞表面Fc受体(FcγRIIIa)来发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒性作用(CDC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)等功能。在肿瘤治疗中,单克隆抗体治疗的核心仍是ADCC效应,体外研究已证明通过NK细胞等免疫效应细胞表达的FcγⅢa受体在单克隆抗体对抗恶性肿瘤细胞系的 ADCC中的重要作用。

图1. 抗体发挥作用的方式[2]

抗体抗肿瘤药物的销售市场广阔。据最新药品销售数据,2021年销售额排第一的K药(Keytruda)销售额达到171.8亿美元,近年来,Keytruda的适应症仍不断扩大,目前在全球获批的适应症超30项,包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部癌、结直肠癌、宫颈癌等;排第二的O药(Opdivo)则是全球首个获批的PD-1抑制剂。自2014年7月获批以来,Opdivo已在60多个国家和地区获批治疗10余个癌种,涵盖肺癌、头颈癌、胃癌、食管癌、肝癌、肾癌、结直肠癌等。2021年TOP 10肿瘤单抗药的全球销售总额超过430亿美元,其中1997年上市的利妥昔单抗,销售额仍达到27.7美金,可见抗体抗肿瘤药物的巨大市场和强大的生命力。2021年肿瘤单抗药全球销售额TOP 10榜单见下图:

表1. 2021年全球TOP10抗肿瘤单抗销售额

根据国内2021年抗肿瘤市场前三季度药品销售数据,在TOP10产品中,包含4款生物药,这四款单抗产品分别为贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗[3]。其中曲妥珠单抗从基础到临床的诸多研究均已充分证实ADCC效应是其重要作用机制,岩藻糖敲除的曲妥珠单抗在体外活性和体内药效学评价上都具有明显的优势,有望在不久的将来取代曲妥珠单抗[4]。

三、ADCC与去岩藻糖

细胞依赖的细胞毒性作用(ADCC)是通过自然杀伤细胞(NK细胞)的Fc受体(如FcγRIIIa)与已结合在靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合,进而活化,释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质直接杀伤靶细胞的作用。

从上世纪90年代开始,临床研究发现ADCC是治疗性抗体(如抗Her2抗体[4,5]、抗CD20抗体[6-8])临床疗效的关键机制之一,对于抗体发挥疗效至关重要。而抗体与Fc受体(如FcγRIIIa)的结合情况直接影响抗体的ADCC效应功能,可以通过增强抗体与Fc受体(如FcγRIIIa)的结合能力,进而增强ADCC效应,增强抗体临床治疗效果。

而抗体分子在重链297位天冬酰胺(Asn297)上存N-糖基化位点,Asn297处的糖修饰结构调节了抗体Fc结构域与Fc受体结合的构象状态。早在近20年前,研究发现去除或降低N-糖上核心岩藻糖后(如图2),治疗性抗体(如抗CD20抗体[9,10]、抗Her2抗体[11]、抗EGFR抗体[12]、抗CCR4抗体[13]等)有更强的与FcγRIIIa的亲和力、更强的ADCC活性,并在动物体内或临床表现出更好的疗效。

目前,2种无岩藻糖修饰的单克隆抗体已被FDA批准用于癌症治疗。[9]

图2. 岩藻糖与ADCC活性关系示意图[14]

四、去岩藻糖化的成功案例

日本麒麟制药公司利用同源重组技术对CHO细胞中的α-1,6岩藻糖转移酶(FUT8)进行基因干扰,得到了三株能够用于工业生产完全无岩藻糖抗体的CHO细胞株,其表达的抗CD20抗体相对于野生型抗体来说,ADCC效应提高100多倍。

2012年3月,日本麒麟制药公司的Mogamulizumab在日本批准上市,这是第一个上市的糖蛋白工程抗体,在治疗性抗体领域具有里程碑的意义。Mogamulizumab是靶向CC趋化因子受体4(CCR4)的人源化单克隆抗体(mAb),而CCR4经常表达于包括皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)在内的某些血液恶性肿瘤细胞。协和麒麟通过降低mogamulizumab的糖链结构中的岩藻糖成分,增强了ADCC效应,对恶性血液疾病进行治疗。2020年,Mogamulizumab的全球销售额仍达到1.26亿美元。

第二个被FDA批准上市的无岩藻糖修饰的单克隆抗体是罗氏的obinutuzumab,这是第二代anti-CD20单抗,在抗体制备的过程中过表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶3和高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ,去除了50%的盐藻糖修饰,从而降低抗体岩藻糖的含量,进而增强ADCC效应。与第一代产品利妥昔单抗相比,第二代产品obinutuzumab对人FcγRIII的亲和力较第一代高50倍,其对表达CD20的淋巴瘤细胞系的ADCC效应增加了10-100倍,在临床上也体现了治疗的优越性。2020年,obinutuzumab全球销售额约7.24亿美元。

五、昭衍生物平台优势

昭衍生物在自主知识产权的CHO-K1基础上进行岩藻糖敲除,获得了完全无岩藻糖的宿主细胞,通过抗体表征及功能验证,得到了完全无岩藻糖的可应用于工业生产的细胞株CHO-K1-TGZ。

抗体表达验证:利用3个不同靶点转染CHO-K1-TGZ进行抗体表达及功能测试(图3),通过minipool转染及筛选,补料流加培养,细胞培养14天后细胞活率仍大于90%,平均产量为3.88g/L。

图3. CHO-K1-TGZ表达抗体细胞生长曲线及产量比较

抗体亲和力测定:利用Biacore检测抗体与抗原FcγRIIIa亲和力,结果见图4,通过结合和解离曲线显示,去岩藻糖基化的宿主细胞(CHO-K1-TGZ)表达的抗体较野生型CHO细胞(CHO-K1)表达的抗体与FcγRIIIa结合的亲和力提高了约6倍。

图4. 表达抗体与FcγRIIIa (V176)亲和力测定

抗体ADCC活性验证:ADCC检测由去岩藻糖基化的宿主细胞(CHO-K1-TGZ)表达的抗体(SF4)和野生型CHO细胞(CHO-K1)表达的抗体(对照)对靶细胞的ADCC效应进行比较,结果显示由去岩藻糖基化的宿主细胞表达的抗体相对于野生型CHO细胞表达的抗体介导的NK细胞对靶细胞的杀伤具有明显提高,其ADCC EC50值提高了约43倍(图5)。

 

图5. 表达抗体ADCC活性测定

抗体糖型鉴定:所得抗体经PNGaseF处理,获得游离的N-糖链;2-AB衍生标记后经亲水作用色谱分离-荧光和质谱检测(HILIC-FLR-MS/MS),图6所示,通过去岩藻糖基化的宿主细胞(CHO-K1-TGZ)表达的抗体未发现含有岩藻糖的N-糖链,岩藻糖被完全敲除;此外主要糖型皆为常见的IgG糖型:G0、G1、G2,不含免疫厡性的糖型、复杂糖型以及高甘露糖糖型。

图6. 表达抗体糖型鉴定

随着抗体类药物在市场上占有举足轻重的地位,细胞工程研究也有了更加广泛的应用。日本已经上市了无岩藻糖抗体,并且有越来越多的无岩藻糖抗体应用于临床研究中。因此,构建可以产生此抗体的细胞株具有很高的实用价值。昭衍生物拥有自主知识产权的岩藻糖敲除宿主细胞株(CHO-K1-TGZ),已成功应用于抗体药物生产,使抗体药效得以大幅提升。

 

 

参考资料:

1,药渡数据库.
2,Nitin Agarwal etal; N-Glycosylation of IgG and IgG-Like Recombinant Therapeutic Proteins: Why Is It Important and How Can We Control It? ; Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2020. 11:13.1-13.28.
3,药融云数据;最高涨237% | 抗肿瘤药销售Top10公布(附名单).
4,Lewis, G. D. et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 37, 255-263 (1993).
5,Musolino, A. et al. Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol 26, 1789-1796, doi:10.1200/JCO.8957 (2008).
6,Cartron, G. et al. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99, 754-758 (2002).
7,Weng, W. K. & Levy, R. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21, 3940-3947, doi:10.1200/JCO.2003.013 (2003).
8,Anolik, J. H. et al. The relationship of FcgammaRIIIa genotype to degree of B cell depletion by rituximab in the treatment of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 48, 455-459, doi:10.1002/art.10764 (2003).
9,Shinkawa, T. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of biological chemistry 278, 3466-3473, doi:10.1074/jbc.M210665200 (2003).
10,Shibata-Koyama, M. et al. Nonfucosylated rituximab potentiates human neutrophil phagocytosis through its high binding for FcgammaRIIIb and MHC class II expression on the phagocytotic neutrophils. Experimental hematology 37, 309-321, doi:10.1016/j.exphem.2008.11.006 (2009).
11,Junttila, T. T. et al. Superior in vivo efficacy of afucosylated trastuzumab in the treatment of HER2-amplified breast cancer. Cancer research 70, 4481-4489, doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-3704 (2010).
12,Oppenheim, D. E. et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. British journal of cancer 110, 1221-1227, doi:10.1038/bjc.2014.35 (2014).
13,Beck, A. & Reichert, J. M. Marketing approval of mogamulizumab: a triumph for glyco-engineering. mAbs 4, 419-425, doi:10.4161/mabs.20996 (2012).
14,Satoh, M., Iida, S. & Shitara, K. Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert opinion on biological therapy 6, 1161-1173, doi:10.1517/14712598.6.11.1161 (2006).